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高敏PCR試劑盒(熔解確認(rèn)版) ——快靈高敏試劑盒“PLUS”!
發(fā)布時(shí)間 : 2021-06-28 16:07:19自2020年10月上??祆`發(fā)布“非洲豬瘟高敏PCR試劑盒”(下稱高敏試劑盒)以來,其出色的靈敏度、敏感性、特異性及穩(wěn)定性迅速被廣大豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可。隨著熒光PCR相關(guān)技術(shù)的普及以及用戶群體的增大,部分之前未被重視的問題也逐漸顯露出來。本篇我們探討下各廠家都諱莫如深的一個(gè)點(diǎn)——“假陽(yáng)”問題,以及相應(yīng)的解決方案。
“假陽(yáng)”問題,事實(shí)上在熒光PCR領(lǐng)域并不少見,而造成假陽(yáng)產(chǎn)生的原因也是紛繁復(fù)雜:如操作不當(dāng)污染、環(huán)境氣溶膠污染或者試劑生產(chǎn)過程污染等。本文所要探討的“假陽(yáng)”,主要指因試劑特異性導(dǎo)致的假陽(yáng),換句話說,即文中所提的“假陽(yáng)”,與操作者、儀器、環(huán)境均無關(guān),只與試劑盒內(nèi)的試劑有關(guān)。那么試劑盒中到底什么與“假陽(yáng)”相關(guān)呢?縱觀商業(yè)化的非瘟病毒PCR檢測(cè)試劑盒,其中都會(huì)提及一個(gè)重要參數(shù)——特異性。
何為特異性呢?在PCR擴(kuò)增過程中,如果我們要擴(kuò)增的非洲豬瘟DNA片段在整條DNA鏈上不止出現(xiàn)了一次,或者樣品中混有的其他物種、細(xì)胞或病毒的DNA中含有類似的DNA片段,則可能會(huì)將其他片段擴(kuò)增出來,那最后儀器顯示出來的陽(yáng)性結(jié)果就不一定是非瘟病毒DNA造成的,于是陽(yáng)性結(jié)果也就變成了假陽(yáng)。因此,通俗來說,特異性反應(yīng)的是試劑盒能擴(kuò)增出特定DNA片段的性能,特異性越低,則試劑盒擴(kuò)增其他片段的概率就越大,即“假陽(yáng)”幾率更大。
市售的眾多非瘟病毒PCR檢測(cè)試劑盒中,絕大多數(shù)廠商在宣傳其試劑盒特異性時(shí)均會(huì)標(biāo)注>99%,最低也不會(huì)低于98%,快靈的高敏試劑盒也是如此,特異性可達(dá)到99.9%,屬實(shí)是已經(jīng)做到了極限,即使PCR技術(shù)發(fā)展至今,因?yàn)槟0錎NA的不確定,依然無法保證100%的特異性。也正因此,特異性,也就是假陽(yáng)的問題是被大家忽視了。
在服務(wù)客戶的過程中,我們發(fā)現(xiàn)很多客戶在進(jìn)行非瘟病毒檢測(cè)遇到極弱樣本或疑似樣本時(shí),對(duì)于陽(yáng)性場(chǎng),往往遵循的是“寧殺錯(cuò),不放過”,而對(duì)于陰性場(chǎng),往往帶來心理的恐慌,需要確認(rèn)到底是不是陽(yáng)性。的確,隨著非瘟一波波的襲來,各檢測(cè)單位的工作量都史無前例的倍增,再重新來一遍的全面復(fù)核,顯然是對(duì)人力和成本的巨大考驗(yàn)。面對(duì)這樣的大環(huán)境,快靈人陷入了沉思。
“我們?yōu)槭裁匆獙帤㈠e(cuò)?”
“當(dāng)真沒有辦法消除假陽(yáng)么?”
帶著這樣的問題,我們開始了新的一輪又一輪的嘗試:提升試劑盒的靈敏度、將特異性由99%提升至99.9%……或許,我們可以把眼界放寬,不局限于單純的擴(kuò)增?
于是,高敏試劑盒上市半年后,我們?cè)诟呙粼噭┖谢A(chǔ)之上研發(fā)出其“升級(jí)版”——快靈高敏試劑盒(熔解確認(rèn)版)。
快靈高敏試劑盒(熔解確認(rèn)版),其性能參數(shù)與高敏試劑盒一致,我們同樣保證其靈敏度、敏感性、穩(wěn)定性、特異性處在行業(yè)頂尖水平,確??蛻艨梢缘谝粫r(shí)間檢測(cè)出陽(yáng)性樣本。包括其操作、擴(kuò)增階段也與高敏試劑盒別無二致,至此,我們可以把快靈高敏試劑盒(熔解確認(rèn)版)等同于高敏試劑盒。詳見表1:
表1:高敏試劑盒與假陽(yáng)確認(rèn)試劑盒基本性能參數(shù)對(duì)比
性能 | 高敏試劑盒 | 高敏試劑盒(假陽(yáng)確認(rèn)版) |
靈敏度 | 400copies/mL | 400copies/mL |
敏感性 | ≥99.9% | ≥99.9% |
特異性 | ≥99.9% | ≥99.9% |
穩(wěn)定性 | CV<3% | CV<3% |
規(guī)格 | 50T/盒 | 50T/盒 |
反應(yīng)體系 | 25μL | 25μL |
反應(yīng)時(shí)長(zhǎng) | 55min | 55min(單擴(kuò)增) 70min(擴(kuò)增+熔解) |
UDG酶 | 有 | 有 |
內(nèi)標(biāo) | 有 | 有 |
但,重點(diǎn)來了!快靈是怎么做到的?快靈高敏試劑盒(熔解確認(rèn)版)突破性地使用了一個(gè)新的反應(yīng)程序——熔解曲線。熔解曲線能鑒別不同的DNA片段,依靠的不是Ct.值,而是其特有的熔解峰,即Tm值,即使一個(gè)DNA片段中僅相差一個(gè)堿基,都能導(dǎo)致Tm值變動(dòng)。依靠Tm值的判定就可以確認(rèn)之前擴(kuò)增陽(yáng)性的非瘟樣本是否為真的非瘟陽(yáng)性,以此達(dá)到鑒別假陽(yáng),消除客戶疑慮的目的。
圖1:擴(kuò)增曲線Ct.值判讀陰陽(yáng) 圖2:熔解曲線檢測(cè)疑似/弱陽(yáng)樣本,排除假陽(yáng)
非瘟新形勢(shì)下,除了要求試劑盒更早的檢測(cè)出陽(yáng)性,更需要真正“精準(zhǔn)”檢測(cè)??祆`高敏試劑盒(熔解確認(rèn)版)除了超高的靈敏度、特異性,更是“自帶”熔解曲線,讓假陽(yáng)無處可藏,讓弱陽(yáng)“站得住腳”,真正做到打消客戶疑慮,真正做到“不殺錯(cuò)、不放過”。